Разработка терапевтических антител к интерлейкину 11 (IL-11) для лечения онкологических заболеваний желудочно-кишечного тракта (руководитель Е.А. Пермяков)

Этап №1

В ходе выполнения проекта по Соглашению о предоставлении субсидии от 28 ноября 2014 г. № 14.607.21.0097 с Минобрнауки России в рамках федеральной целевой программы «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2014-2020 годы» на этапе №1 в период с 28.11.2014 по 31.12.2014 были проведены следующие работы:

Проведена характеризация рекомбинантных форм человеческих целевых белков: интерлейкина 11 (IL-11), растворимых фрагментов рецепторов IL-11 и gp130.
Разработаны генетические конструкции для получения мышиных и обезьяньих ортологов IL-11, а также полноразмерных форм рецепторов IL-11 и gp130.
Проведена закупка расходных материалов.
Проведены патентные исследования.
Написан аналитический обзор современной научно-технической и нормативной литературы, обоснован выбор направления исследования.
Арендовано необходимое аналитическое и контрольно-измерительное оборудование.

При этом были получены следующие результаты:

Созданы плазмидные векторы на основе плазмиды pET28b для бактериальной продукции в E. coli рекомбинантных форм интерлейкина 11 человека, мыши и макаки. Разработаны методы наработки, выделения из телец включения, ренатурации и очистки рекомбинантных форм IL-11. Конечный вы-ход IL-11 с 1 л бактериальной среды составил около 10 мг, 15 мг и 8 мг для IL-11 человека, макаки и мыши, соответственно. Чистота препаратов IL-11 составляет 80%-95%.
Создан плазмидный вектор на основе плазмиды pTT10 для высокоэффективной транзиентной сек-реционной наработки в культуре клеток млекопитающих рекомбинантной формы интерлейкина 11 человека, несущего на C-конце 6xHis и FLAG метки. Разработаны методы наработки рекомбинант-ного IL-11 в клетках CHO-T, его выделения и очистки. Конечный выход IL-11 с 1 л культуральной среды составил около 8 мг. Чистота препарата IL-11 составила свыше 90%.
Созданы плазмидные векторы на основе плазмиды pTT10 для высокоэффективной транзиентной секреционной наработки в культуре клеток млекопитающих рекомбинантных форм внеклеточного домена рецептора интерлейкина 11 человека, несущего на C-конце Fc-фрагмент IgG1 человека, либо 6xHis и FLAG метки. Разработаны методы наработки рекомбинантного внеклеточного домена IL-11RA в клетках CHO-T, его выделения и очистки. Конечный выход белка с 1 л культуральной среды составил около 12 и 5 мг для IL11RA-Fc и IL11RA-H6-FLAG, соответственно. Чистота препаратов внеклеточного фрагмента IL-11RA составила свыше 90%.
Создан плазмидный вектор на основе плазмиды pTT12 для высокоэффективной транзиентной сек-реционной наработки в культуре клеток млекопитающих рекомбинантного внеклеточного домена рецептора gp130 человека, несущего на C-конце Fc-фрагмент IgG1 человека. Разработан метод нара-ботки белка в клетках CHO-T, его выделения и очистки. Конечный выход gp130-Fc с литра культу-ральной среды составил около 11 мг. Чистота препарата gp130-Fc составила свыше 95%.
Создан плазмидный вектор на основе плазмиды pCMV6-AC, несущий полноразмерный ген α-субъединицы рецептора интерлейкина 11 человека, предназначенный для создания стабильной ли-нии-продуцента полноразмерной мембранной формы IL11RA в культуре клеток млекопитающих.
Создан плазмидный вектор на основе плазмиды pCMV6-XL6, несущий полноразмерный ген рецеп-тора gp130 человека, предназначенный для создания стабильной линии-продуцента полноразмерной мембранной формы рецептора gp130 в культуре клеток млекопитающих.
Изучение взаимодействия полученных препаратов интерлейкина 11 с внеклеточным доменом α-субъединицы рецептора интерлейкина 11 человека методом иммуноферментного анализа показало наличие специфического взаимодействия между изучаемыми препаратами IL11 и IL11RA, что сви-детельствует об их функциональной активности и, соответственно, пригодности для использования на дальнейших стадиях получения и тестирования фрагментов человеческих антител, ингибирую-щих взаимодействие IL11-IL11RA.
Проведённый в соответствии с ГОСТ Р 15.011-96 патентный поиск по тематике проекта показал, что заявленное в проекте техническое решение отличается от обнаруженных в уровне техники ре-шений, что может свидетельствовать о новизне технического решения и целесообразности даль-нейшей разработки.
Проведенный аналитический обзор современной научно-технической и нормативной литературы (соответствует ГОСТ 7.32-2001) показал, что блокирование IL11/IL11RA сигналирования является многообещающим подходом к терапии ряда онкологических заболеваний, включая метастатические формы рака молочной железы, рака печени и большинства онкологических заболеваний желудочно-кишечного тракта.
Арендовано необходимое для выполнения проекта аналитическое и контрольно-измерительное оборудование.

Суммируя результаты работ, проведенных на 1 этапе проекта, настоящий проект не имеет прямых аналогов в мире, обладает высоким потенциалом получения инновационного лекарственного средства для терапии онкозаболеваний, в частности, большинства онкозаболеваний желудочно-кишечного тракта. Результаты проведенных работ по проекту полностью соответствуют плану-графику работ, предъявляемым к ним техническим требованиям, и позволяют рассчитывать на успешное выполнение последующих стадий проекта, и проекта в целом.

Комиссия Минобрнауки России признала обязательства по Соглашению на отчетном этапе исполненными надлежащим образом.

ЭТАП №2

В ходе выполнения проекта по Соглашению о предоставлении субсидии от 28 ноября 2014 г. № 14.607.21.0097 с Минобрнауки России в рамках федеральной целевой программы «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2014-2020 годы» на этапе №2 в период с 01.01.2015 по 30.06.2015 были проведены следующие работы:

Получены стабильные линии животных клеток, экспрессирующих человеческий IL-11R.
Проведены селекции из фаговых библиотек Fab-фрагментов человеческих антител кандидатов, специфичных к IL-11.
Проведены скрининги отобранных кандидатов на предмет специфичности к IL-11.
Секвенированы и проанализированы полученные Fab-фрагменты антител, выбраны наиболее перспективные из них.
Реализованы мероприятия по достижению значений показателей результативности предоставления субсидии.
Разработана программа и методики исследовательских испытаний экспериментальных образцов Fab-фрагментов и полноразмерных моноклональных человеческих антител к интерлейкину 11 человека.
Разработаны методики анализа экспериментальных образцов.

При этом были получены следующие результаты (нарастающим итогом):

Методами генетической инженерии создан ряд плазмидных векторов для бактериальной (E. coli) или эукариотической (CHOT) наработки препаратов IL-11 человека, мыши и макаки, а также растворимой (внеклеточный домен) и полной форм рецепторов IL-11RA и gp130. Разработаны методы получения целевых белков в миллиграммовых количествах, включая методы их наработки, выделения и очистки.
Полученный препарат IL-11 специфически взаимодействует с препаратом внеклеточного домена рецептора IL-11RA человека, что свидетельствует о функциональной активности обоих препаратов.
Получена стабильная линия клеток НЕК-Blue IL-6, экспрессирующая полноразмерный рецептор IL-11RA человека.
Проведены селекции из трех синтетических и двух наивных фаговых библиотек Fab-фрагментов человеческих антител кандидатов, специфичных к IL-11. На каждой из пяти использованных библиотек Fab-фрагментов антител проведены три раунда селекции фаговых частиц, несущих Fab-фрагменты, специфичные к препаратам рекомбинантного IL-11 человека (два раунда селекции) и макаки (один раунд селекции). Использованы две схемы селекции, отличающиеся порядком презентации антигенов.
Проведен скрининг свыше 1200 отобранных Fab-фрагментов, секретированных в штамме E. coli BL21-Gold(DE3), на предмет их специфичности к IL-11 человека. Получены свыше 80 позитивных кандидатов.
Найдены свыше десяти Fab-фрагментов, обладающих уникальной аминокислотной последовательностью CDR-участков тяжелой цепи. Полученные уникальные Fab-фрагменты антител являются основой для дальнейшей разработки антител, высокоспецифичных к IL-11.
Патентный поиск по тематике проекта показал, что заявленное в проекте техническое решение отличается от обнаруженных в уровне техники решений, что может свидетельствовать о новизне технического решения и целесообразности выполнения проекта.
Аналитический обзор современной научно-технической и нормативной литературы показал, что блокирование IL-11/IL-11RA сигналирования является многообещающим подходом к терапии ряда онкологических заболеваний, включая метастатические формы рака молочной железы, рака печени и большинства онкологических заболеваний желудочно-кишечного тракта.
Арендовано необходимое для выполнения проекта аналитическое и контрольно-измерительное оборудование.
Разработана программа и методики исследовательских испытаний экспериментальных образцов Fab-фрагментов и полноразмерных моноклональных человеческих антител к интерлейкину 11 человека.
Разработаны методики анализа экспериментальных образцов.

Суммируя результаты работ, проведенных на этапах 1-2 проекта, настоящий проект не имеет прямых аналогов в мире, обладает высоким потенциалом получения инновационного лекарственного средства для терапии онкозаболеваний, в частности, большинства онкозаболеваний желудочно-кишечного тракта. Результаты проведенных работ по проекту полностью соответствуют плану-графику работ, предъявляемым к ним техническим требованиям, и позволяют рассчитывать на успешное выполнение последующих стадий проекта, и проекта в целом.

ЭТАП №3

В ходе выполнения проекта по Соглашению о предоставлении субсидии от 28 ноября 2014 г. № 14.607.21.0097 с Минобрнауки России в рамках федеральной целевой программы «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2014-2020 годы» на этапе №3 в период с 01.07.2015 по31.12.2015 были проведены следующие работы:

Измерено сродство отобранных на этапе 2 Fab-фрагментов антител к IL-11.
Изучена способность выбранных кандидатов ингибировать связывание IL-11 с внеклеточным сегментом рецептора IL-11 и протеолипосомами, несущими полноразмерный рецептор IL-11.
Наиболее перспективные Fab-фрагменты антител, специфичные к IL-11, переведены в формат полноразмерного антитела.
Разработан функциональный тест на ингибирование IL-11/IL-11RA сигналирования, с использованием контрольных коммерческих ингибиторов этого сигналирования.
Измерено сродство полученных антител к IL-11.
Изучена способность полученных антител ингибировать связывание IL-11 с внеклеточным сегментом рецептора IL-11 и протеолипосомами, несущими полноразмерный рецептор IL-11.
Изучена способность полученных антител блокировать IL-11/IL-11RA сигналирование.
Изучена тепловая, агрегационная и протеолитическая стабильность выбранных антител.
Выбраны кандидаты, подлежащие аффинной и структурной матурации.
Разработаны стратегии матурации выбранных Fab-фрагментов.
Реализованы мероприятия по достижению значений показателей результативности предоставления субсидии.
Проведены маркетинговые исследования с целью изучения перспектив коммерциализации РИД.
Разработаны рекомендации по использованию результатов ПНИЭР в реальном секторе экономики.

При этом были получены следующие результаты (нарастающим итогом):

Методами генетической инженерии создан ряд плазмидных векторов для бактериальной (E. coli) или эукариотической (CHO-T) наработки препаратов IL-11 человека, мыши и макаки, а также растворимой (внеклеточный домен) и полной форм рецепторов IL-11RA и gp130. Разработаны методы получения целевых белков в миллиграммовых количествах, включая методы их наработки, выделения и очистки.
Изучение взаимодействия полученных препаратов IL-11 с внеклеточным доменом рецептора IL-11RA человека показало наличие специфического взаимодействия между изучаемыми препаратами, что свидетельствует об их функциональной активности и пригодности для использования на дальнейших стадиях выполнения проекта.
Получена стабильная линия клеток НЕК-Blue™ IL-6, экспрессирующая полноразмерный рецептор IL-11RA человека.
Проведены селекции из трех синтетических и двух наивных фаговых библиотек Fab-фрагментов человеческих антител (библиотеки принадлежат ООО «Антерикс») кандидатов, специфичных к IL-11. На каждой из использованных библиотек Fab-фрагментов антител проведены три раунда селекции фаговых частиц, несущих Fab-фрагменты, специфичные к препаратам рекомбинантного IL-11 человека (два раунда селекции) и макаки (один раунд селекции). Примененный подход позволяет получить Fab-фрагменты, кроссреактивные к обоим IL-11. Использованы две схемы селекции, отличающиеся порядком презентации антигенов.
Проведен скрининг свыше 1200 отобранных Fab-фрагментов, секретированных в штамме E. coli BL21-Gold(DE3), на предмет их специфичности к IL-11 человека. Получены свыше 80 позитивных кандидатов (доля позитивных клонов 1-29%).
Анализ данных автоматического секвенирования гипервариабельных участков позитивных кандидатов показал наличие свыше десяти Fab-фрагментов, обладающих уникальной аминокислотной последовательностью CDR-участков тяжелой цепи.
Сродство отобранных Fab-фрагментов антител к IL-11 человека достигает 0,2 нМ.
Показана способность выбранных Fab-фрагментов ингибировать связывание IL-11 человека с внеклеточным сегментом рецептора IL-11 и протеолипосомами, несущими полноразмерный рецептор IL-11 человека (эффект от 39% до 93%).
Семь функциональных Fab-фрагментов антител переведены в формат полноразмерного антитела человека подкласса IgG1.
На основе клеток НЕК-Blue™ IL-6, экспрессирующих полноразмерный рецептор IL-11RA человека, разработан функциональный тест для изучения ингибирования IL-11/IL-11RA сигналирования, отслеживаемого по инактивации STAT3.
Сродство полученных антител к IL-11 человека/макаки достигает 7 пМ.
Показана способность полученных антител ингибировать связывание IL-11 человека с внеклеточным сегментом рецептора IL-11 и протеолипосомами, несущими полноразмерный рецептор IL-11 человека (эффект от 39% до 76%).
Для пяти анти-IL-11 антител показана способность ингибировать IL-11/IL-11RA сигналирование при терапевтически значимых концентрациях антитела (эффект 50-70%).
Функциональные антитела характеризуются высокой тепловой и агрегационной стабильностью, а также устойчивостью к сывороточным протеазам.
Выбраны кандидатные антитела, подлежащие аффинной и структурной матурации.
Разработаны стратегии матурации выбранных антител.
Результаты опубликованы в двух статьях и доложены на V Съезде биофизиков, подана заявка на патент. Прочие индикаторы проекта (объем привлеченных внебюджетных средств и возрастной состав исследователей-участников проекта) также удовлетворяют показателям, заложенным в ПГ.
Проведённый патентный поиск по тематике проекта показал, что заявленное в проекте техническое решение отличается от обнаруженных в уровне техники решений, что может свидетельствовать о новизне технического решения и целесообразности выполнения проекта.
Проведенный аналитический обзор современной научно-технической и нормативной литературы показал, что блокирование IL-11/IL-11RA сигналирования является многообещающим подходом к терапии ряда онкологических заболеваний, включая метастатические формы рака молочной железы, рака печени и большинства онкологических заболеваний желудочно-кишечного тракта.
Арендовано необходимое для выполнения проекта аналитическое и контрольно-измерительное оборудование.
Разработана программа и методики исследовательских испытаний экспериментальных образцов анти-IL-11 антител и их Fab-фрагментов.
Разработаны методики анализа экспериментальных образцов.
Проведены маркетинговые исследования с целью изучения перспектив коммерциализации РИД.
Разработаны рекомендации по использованию результатов ПНИЭР в реальном секторе экономики.

Суммируя результаты работ, проведенных на этапах 1-3 проекта, настоящий проект не имеет прямых аналогов в мире, обладает высоким потенциалом получения инновационного лекарственного средства для терапии онкозаболеваний, в частности, большинства онкозаболеваний желудочно-кишечного тракта. Результаты проведенных работ полностью соответствуют плану-графику работ и позволяют рассчитывать на успешное выполнение последующих стадий проекта, и проекта в целом.

Комиссия Минобрнауки России признала обязательства Получателя субсидии на этапе №3 Плана-графика Соглашения исполненными.

ЭТАП №4

В ходе выполнения проекта по Соглашению о предоставлении субсидии от 28 ноября 2014 г. № 14.607.21.0097 с Минобрнауки России в рамках федеральной целевой программы «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2014-2020 годы» на этапе №4 в период с 01.01.2016 по 30.06.2016 были проведены следующие работы:

Создание матурационных фаговых библиотек Fab-фрагментов человеческих антител.
Проведение селекций из матурационных фаговых библиотек Fab-фрагментов антител кандидатов, специфичных к IL-11.
Проведение скринингов отобранных кандидатов на предмет специфичности к IL-11.
Секвенирование и анализ отобранных клонов Fab-фрагментов антител, выбор наиболее перспективных из них.
Реализация мероприятий по достижению значений показателей результативности предоставления субсидии.
Разработка проекта технического задания на проведение ОТР по доклиническим исследованиям и разработке технологии.
Проектирование экспериментального производства.
Разработка методик получения и контроля качества субстанции.

При этом были получены следующие результаты (нарастающим итогом):

Методами генетической инженерии созданы плазмидные векторы для бактериальной или эукариотической наработки препаратов IL-11, а также растворимой и полной форм рецепторов IL-11RA и gp130. Разработаны методы наработки, выделения, очистки и функциональной характеризации целевых белков. Получена стабильная линия клеток НЕК-Blue™ IL-6, экспрессирующая полноразмерный рецептор IL-11RA, на основе которой разработан функциональный тест для изучения ингибирования IL-11/IL-11RA сигналирования, отслеживаемого по инактивации STAT3. Проведены селекции из трех синтетических и двух наивных фаговых библиотек Fab-фрагментов антител человека кандидатов, специфичных к IL-11. На каждой из использованных библиотек Fab-фрагментов антител проведены три раунда селекции фаговых частиц, несущих Fab-фрагменты, специфичные к препаратам рекомбинантного IL-11 человека и макаки. Проведен скрининг свыше 1200 бактериально секретированных отобранных Fab-фрагментов на предмет их специфичности к IL-11. Получены свыше 80 позитивных кандидатов, среди которых найдены свыше десяти уникальных Fab-фрагментов, обладающих уникальной аминокислотной последовательностью CDR-участков тяжелой цепи. Отобранные Fab-фрагменты антител к IL-11 обладают сродством к IL-11 до 0,2 нМ, способны ингибировать связывание IL-11 с растворимой формой рецептора IL-11 и протеолипосомами, несущими полноразмерный рецептор IL-11. Семь функциональных Fab-фрагментов антител переведены в формат полноразмерного антитела человека подкласса IgG1. Полученные антитела к IL-11 обладают сродством к IL-11 до 7 пМ, способны ингибировать связывание IL-11 с растворимой формой рецептора IL-11 и протеолипосомами, несущими полноразмерный рецептор IL-11RA. Пять анти-IL-11 антител способны ингибировать IL-11/IL-11RA сигналирование при терапевтически значимых концентрациях антитела (эффект 50-70%). Функциональные антитела характеризуются высокой тепловой и агрегационной стабильностью, а также устойчивостью к сывороточным протеазам. На основе наиболее активного анти-IL-11 антитела U#19 создана матурационная фаговая библиотека Fab-фрагментов антител человека с измененными методом шаффлинга CDR-участками легкой цепи. Скринингом свыше 3200 бактериально секретированных Fab-фрагментов выявлены около 120 клонов, специфичных к IL-11, из которых уникальны 9 клонов. На основе клона, обладающего минимальной кинетической константой диссоциации комплекса с IL-11, создана фаговая библиотека Fab-фрагментов антител с рандомизированными по типу NNK шестью остатками CDR3-участка тяжелой цепи. Скринингом свыше 1200 бактериально секретированных Fab-фрагментов выявлены около 80 клонов, специфичных к IL-11, из которых уникальны 5 клонов. Проведена разработка сопутствующей научно-технической документации, включая программу и методики исследовательских испытаний экспериментальных образцов, маркетинговые исследования, рекомендации по использованию результатов проекта в реальном секторе экономики, проект технического задания на проведение ОТР по доклиническим исследованиям и разработке технологии, проект экспериментального производства, методики получения и контроля качества субстанции. Патентный поиск показал, что реализуемое в проекте техническое решение отличается от обнаруженных в уровне техники решений, что свидетельствует о его новизне. Разработанные в проекте анти-IL-11 кандидаты являются перспективной базой для получения высокоэффективных ингибиторов IL-11/IL-11RA сигналирования, предназначенных для терапии ряда онкологических заболеваний, включая метастатические формы рака молочной железы, рака печени и большинства онкологических заболеваний желудочно-кишечного тракта.

Суммируя результаты проведенных работ, настоящий проект не имеет прямых аналогов в мире, обладает высоким потенциалом получения инновационного лекарственного средства для терапии онкозаболеваний, в частности, большинства онкозаболеваний желудочно-кишечного тракта. Результаты проведенных работ полностью соответствуют плану-графику работ и позволяют рассчитывать на успешное выполнение заключительного этапа проекта, и проекта в целом.

Комиссия Минобрнауки России признала обязательства Получателя субсидии на этапе №4 Плана-графика Соглашения исполненными надлежащим образом.